立命館大学 
増山研 分子栄養学研究室

細胞培養

osteoclast culture:hematopoietic cells

Dag 1: Isolatie femur/tibia
Femur/Tibia flushen met alpha-MEM, 10% FCS
10’ 1000 rpm
Pellet resuspenderen in 6 ml medium
6 ml celsuspensie aanbrengen bovenop 4 ml Ficoll-Paque
10’ 2000 rpm
2x wassen (5’ 1000 rpm)
Cellen overnacht laten plakken in een cultuurplaat (10 cm) met MCSF (10 ng/ml)

Dag 2:
Niet-plakkende cellen afnemen en uitplaten in een 48-well plaat (125000 cellen/well), samen met RANKL (100 ng/ml) en MCSF (20 ng/ml)

Dag 7:
Stop van de culturen, RNA isolatie, TRAPkleuring

Bone marrow stromal cell cultures

Tibia isoleren en proper maken
Epifyse afknippen (afsnijden met steriel mesje), onderste epifyse afknippen terhoogte van de aanhechting van de fibula
Beenmerg flushen met 10 ml DMEM (21969-03) zonder serum (oranje naald)
Celsuspensie doorheen 70 µm filter
Celsuspensie centrifugeren: 10 min. 1000 rpm
Pellet resuspenderen in 5-10 ml (afhankelijk van het aantal cellen)
Cellen tellen met 3% acetic acid
Cellen uitplaten in 6 well plaat (DMEM, 15% FCS, 1% P/S, 1% glutamine) : 200000 cellen/well
Dag na het uitplaten van de cellen: medium afhalen en vervangen door DMEM, 15% FCS, P/S, glutamine met 50 µg/ml ascorbic acid, 10 mM β-glycerophosphate en 10-8 M dexamethasone. (voor 50 ml medium: 500 µl ascorbic acid oplossing 25 mg/5ml / 108 mg β-glycerophosphate / 50 µl verdunde dexamethasone oplossing)
Om de 3-4 dagen opnieuw stimuleren

Kleuringen
Na 7 en 14 dagen cultuur: Alkalisch fosfatase
Medium afnemen en cellen wassen met PBS-
Fixatie met PLP: Periodic acid Lysine Paraformaldehyde:

Component A
: 0,1 M Lysine – 0,05 M Natriumfosfaatbuffer pH 7,4
Los 1,462 g L-Lysine (Karen en Riet) op in 50 ml H2O (0,2 M Lysine) en breng dit op pH 7,4 met 2N HCl
Breng dit op 100 ml met natriumfosfaatbuffer pH 7,4 (0,1M), osmolariteit moet ongeveer 300 m osmol zijn
Bewaar ingevroren

Component B
: 8 % paraformaldehyde opgelost in PBS-
Bewaar bij 4 °C

Component C
: 21,4 mg Natrium meta-perjodaat (Sophie T)/10ml, bewaar bij KT in donker          

Neem vlak voor gebruik 3 delen A en voeg die bij 1 deel B. Voeg dit mengsel toe aan buis C en meng goed.

Fixatie: 10 minuten
Fixator afnemen en kleuren
Alkalisch fosfatase
5 mg Naphtol AS-MX (Sigma, diepvries) in 250 µl N,N – Dimethylformamide (trekkast) + 100 µl MgCl2 1M + 30 mg Fast Blue (diepvries) + 5 ml 1M Tris HCL pH 8,5 aanlengen tot 50 ml met H20 Baxter
Oplossing filtreren door filtreerpapier
60 minuten kleuren
Kleurstof eraf halen
Spoelen met H2O Baxter en laten drogen

Na 21 dagen cultuur: Mineralizatie met Alizarin Red
Medium afnemen en spoelen met PBS
Cellen 20 minuten fixeren met 100 % methanol KOUD (diepvries -20 °C)
Rehydratatie met AD (5 min)
30 minuten kleuren met 0,1 % (wt/vol) (=1 mg/ml) Alizarin Red (pH ~ 6,2)
Wassen: 3 X 15 min met AD
Eventueel tegenkleuren met hematoxylin (kort, op en afnemen)
Wassen met AD

お問い合わせ

立命館大学 
食マネジメント学部
増山研 分子栄養学研究室

〒525-8577

滋賀県 草津市 野路東 1-1-1
アクロスウィング606
TEL/FAX 077-599-3057
実験室内線 (6162)

<大学院生募集>
立命館大学大学院 食マネジメント研究科
博士前期課程・博士後期課程

<研究補助員募集>
業務内容:実験作業およびデータ整理の補助

お問い合わせフォームよりご連絡ください。

問い合わせフォームはこちら
PAGE TOP