立命館大学　
増山研　分子栄養学研究室

• 反応液の組成を確認、ノートに記載
• サンプル数の数倍した組成を計算する
• 遺伝子型判定PCRでは、ゲノムDNA溶液H2Oで10倍希釈する　10 mLDNA + 90 mL　std H2O
• 反応液の構成：希釈したゲノムDNA(鋳型となるDNA)は1mLを反応に用いる

＜VDR WT/fl PCR＞
10X Buffer                     2.5 uL
dNTP                             0.25 uL　
primer F (TEI FS2)          0.25 uL
primer R (TEI AS2)         0.25 uL
std.H2O                       20.65 uL
Taq                                0.1 uL
Total                             24 uL

＜VDR KO PCR＞
10X Buffer                    2.5 uL
dNTP mix                     0.25 uL
primer F (TEI FS2)        0.25 uL
primer R (in2 AS2)        0.25 uL
std. H2O                    20.65 uL
Taq                              0.1 uL
Total                          24uL

＜VDR fl digest＞
VDR fl　PCR終了後、チューブの蓋を開け、以下のdigest mixを25Lずつ加え、37℃にて 3時間、dry oven内でインキュベートし、電気泳動を行う。
H Buffer         5 uL
EcoRI            0.1 uL
std. H2O      19.9 uL
Total            25 uL

＜vill cre PCR＞
10X Buffer                    2.5 uL
dNTP mix                      0.5 uL
primer F (F)                  0.5 uL
primer R (R)                 0.5 uL
std. H2O                     19.9 uL
Taq                              0.1 uL
Total                          24uL

＜ckm cre PCR＞
10X Buffer                    2.5 uL
dNTP mix                     0.5 uL
primer F (F)                 0.5 uL
primer R (R)                 0.5 uL
std. H2O                     19.9 uL
Taq                               0.1 uL
Total                           24 uL

＜Camp PCR＞
KAPA2G mix                     6 uL
primer F (camp mu F)       0.3 uL
primer R (camp mu R)      0.3 uL
std. H2O                          4.4 uL
Total                              11 uL

＜Enpp1 asj PCR＞
KAPA2G mix                    6 uL
primer F (F)                    0.6 uL
primer R (R)                   0.6 uL
std. H2O                        3.8 uL
Total                            12 uL

＜Enpp1 digest＞
Enpp1 asj　PCR終了後、チューブの蓋を開け、以下のdigest mixを25Lずつ加え、thermal cyclerのenpp1 digest プログラムにてインキュベート、終了後に電気泳動
Cut SMART Buffer   1.2 uL
Taqa1                    1 uL
std. H2O                5.8 uL
Total                      8 uL

• 薬包紙を4つ折りにして秤にのせ、風袋消去（薬包紙をのせた状態で０にする）する。
• アガロースのボトルを軽くたたいて振動させ、薬包紙に必要量を移す。薬さじは用いない。
• 薬包紙にはかり取ったアガロースを、ゲル作成用のボトルに移す。
• 1XTAE bufferを必要量ボトルに入れる。
• ボトルを揺らし、アガロース粉末をTAEに馴染ませ、電子レンジで600W 1分加熱
• キムタオルか台拭きでボトル上部を持ち、ボトルを揺らしてアガロースを完全に溶かす。
• 再度、電子レンジで600W 1分加熱
• 軽く揺らし、空気を出し他の後、ボトル外側を流水で冷やす（冷やす位置を少しずつずらしながら、冷やしすぎないように注意）
• ボトルを手で数秒触っていられる程度になったら、4℃冷蔵庫からEt-Brを出し、10 uL加える。Et-Brを加えたゲルは泡立てないようにボトルを回しながら均一化する。
• ゲル作成用の枠をセットし、泡立てないようにゲルを流し入れ、コームをセットする。
• 軽くペーパータオル等で覆い、ゲルが固まるまで放置する。
• 固まったゲルは、濃度別の保存用タッパーに移し、4℃で保存する。