立命館大学 
増山研 分子栄養学研究室

genotyping PCR - 電気泳動

PCR法

  • 反応液の組成を確認、ノートに記載
  • サンプル数の数倍した組成を計算する
  • 遺伝子型判定PCRでは、ゲノムDNA溶液H2Oで10倍希釈する 10 mLDNA + 90 mL std H2O
  • 反応液の構成:希釈したゲノムDNA(鋳型となるDNA)は1mLを反応に用いる
   Buffer:ポリメラーゼ反応に適した塩濃度、pH環境に調整する。10倍濃度のものが多い
   dNTP:塩基 鋳型DNAと相補鎖となるようにプライマーの3’側に結合する塩基
   primer:鋳型DNAの配列の一部 20塩基程の長さのDNA断片 センス(もしくはF)、
   アンチセンス(もしくは R)の2本で1セット
   ポリメラーゼ:塩基を繋げる酵素  増山研では主にTaqかKAPAを使用

PCR 条件

<VDR WT/fl PCR
10X Buffer                     2.5 uL
dNTP                             0.25 uL 
primer F (TEI FS2)          0.25 uL
primer R (TEI AS2)         0.25 uL
std.H2O                       20.65 uL
Taq                                0.1 uL
Total                             24 uL

<VDR KO PCR
10X Buffer                    2.5 uL
dNTP mix                     0.25 uL
primer F (TEI FS2)        0.25 uL
primer R (in2 AS2)        0.25 uL
std. H2O                    20.65 uL
Taq                              0.1 uL
Total                          24uL

<VDR fl digest
VDR fl PCR終了後、チューブの蓋を開け、以下のdigest mixを25Lずつ加え、37℃にて 3時間、dry oven内でインキュベートし、電気泳動を行う。
H Buffer         5 uL
EcoRI            0.1 uL
std. H2O      19.9 uL
Total            25 uL

<vill cre PCR
10X Buffer                    2.5 uL
dNTP mix                      0.5 uL
primer F (F)                  0.5 uL
primer R (R)                 0.5 uL
std. H2O                     19.9 uL
Taq                              0.1 uL
Total                          24uL

<ckm cre PCR
10X Buffer                    2.5 uL
dNTP mix                     0.5 uL
primer F (F)                 0.5 uL
primer R (R)                 0.5 uL
std. H2O                     19.9 uL
Taq                               0.1 uL
Total                           24 uL

<Camp PCR
KAPA2G mix                     6 uL
primer F (camp mu F)       0.3 uL
primer R (camp mu R)      0.3 uL
std. H2O                          4.4 uL
Total                              11 uL

<Enpp1 asj PCR
KAPA2G mix                    6 uL
primer F (F)                    0.6 uL
primer R (R)                   0.6 uL
std. H2O                        3.8 uL
Total                            12 uL

<Enpp1 digest
Enpp1 asj PCR終了後、チューブの蓋を開け、以下のdigest mixを25Lずつ加え、thermal cyclerのenpp1 digest プログラムにてインキュベート、終了後に電気泳動
Cut SMART Buffer   1.2 uL
Taqa1                    1 uL
std. H2O                5.8 uL
Total                      8 uL

アガロースゲル作成

  • 薬包紙を4つ折りにして秤にのせ、風袋消去(薬包紙をのせた状態で0にする)する。
  • アガロースのボトルを軽くたたいて振動させ、薬包紙に必要量を移す。薬さじは用いない。
  • 薬包紙にはかり取ったアガロースを、ゲル作成用のボトルに移す。
  • 1XTAE bufferを必要量ボトルに入れる。
  • ボトルを揺らし、アガロース粉末をTAEに馴染ませ、電子レンジで600W 1分加熱
  • キムタオルか台拭きでボトル上部を持ち、ボトルを揺らしてアガロースを完全に溶かす。
  • 再度、電子レンジで600W 1分加熱
  • 軽く揺らし、空気を出し他の後、ボトル外側を流水で冷やす(冷やす位置を少しずつずらしながら、冷やしすぎないように注意)
  • ボトルを手で数秒触っていられる程度になったら、4℃冷蔵庫からEt-Brを出し、10 uL加える。Et-Brを加えたゲルは泡立てないようにボトルを回しながら均一化する。
  • ゲル作成用の枠をセットし、泡立てないようにゲルを流し入れ、コームをセットする。
  • 軽くペーパータオル等で覆い、ゲルが固まるまで放置する。
  • 固まったゲルは、濃度別の保存用タッパーに移し、4℃で保存する。

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