Webを活用した塩基配列の特異性確認
- 検索サイトで、”ncbi blast” と入力しBLAST画面を表示する。あるいは以下のURLにアクセスする。https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
BLASTでは塩基配列やタンパクのアミノ酸配列から、その特異性を確認することが出来る。
- BLASTのHP画面のWeb BLASTで、知りたい内容を選択する。例えば、論文に記載されているプライマー配列情報を入力し、その配列の特異性、目的遺伝子の染色体DNや、RNAのどの位置を認識するか、そのプライマーを利用しPCRを行った際に、増幅される領域の大きさ等を調べることが出来る。
- 塩基配列から検索する場合は、”Nucleotide BLAST”をクリックする。
- Enter Query Sequenceのボックス内に、塩基配列を入力する。
例）マウスVDR mRNA 発現量測定に用いたプライマー（リアルタイムPCR用）をボックスに入力
GGATCTGTGGAGTGTGTGGAGACC
CTTCATCATGCCAATGTCCACGCAG
- Choose Search Setで条件を設定すると、検索時間を短縮し、データを絞り込むことが出来る、ゲノムDNA、RNA情報検索には、Standard databasesの左側○にチェック、その下のプルダウンはStandard databasesとなっていればOK。ページ下部の”BLAST”をクリックする。
- GGATCTGTGGAGTGTGTGGAGACCのBLAST結果が表示されるまで待つ。
- BLAST ® » blastn suite » results for 、、、、と表示された検索結果画面に切り替わる。
Sequences producing significant alignmentsに、検索したプライマーとマッチする配列の候補がリストアップされる。マウスの学名Mus、分子名 Vdr、mRNAの記載された結果を確認する。Rangeは、RNAのプライマーの位置を示す。同様に、CTTCATCATGCCAATGTCCACGCAGも検索し、RNAの位置を確認する。アンチセンスプライマーの場合、Rangeに表示される数字と、subjectの数字が逆転する。